campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños
moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use.
La técnica clásica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa impregna`a de un electrolito.
Sus extremos se sumergen en dos depósitos independientes que contienen ambos al electrolito y
están unidos a los electrodos del generador de corriente. La muestra se deposita en forma de un
pequeño trazo transversal en la tira. La distancia de migración se mide an relación un marcador
interno. Las placas son reveladas con sales de plata, azul de Coomassie, o reactivos en particular.
Fundamentos y Conceptos Básicos
La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación que se ha desarrollado gracias a los
avances de la cromatografía líquida de alta eficacia junto con los procedimientos más tradicionales
de electroforesis. Esta técnica permite separar bastante bien biomoléculas, donde la cromatografía
líquida se muestra menos eficaz, y compuestos de pequeña masa molecular, difíciles de estudiar
por los procedimientos clásicos de electromigración en soporte.
La electroforesis capilar constituye una adaptación particular de la técnica de electroforesis. Esta
técnica separativa se basa en la migración de las especies de la muestra en disolución, portadoras
de una carga eléctrica global, bajo el efecto de un campo eléctrico y en contacto con un soporte
(medio de desplazamiento) adecuado.
En electroforesis capilar la tira se reemplaza por un tubo capilar abierto en sus extremos, fabricado
con un diámetro pequeño (15 a 150µm). El capilar oscila entre 20 y 80cm, y está lleno de una
solución buffer. Un detector se encuentra ubicado en un extremo del capilar, cerca del
compartimiento catódico. La señal obtenida es la base de la obtención del electroferograma, que
muestra el registro de la composición de la muestra. Solo las especies que se dirigen hacia el
cátodo serán detectadas.
Métodos de Detección
En la detección UV-Vis se mide la intensidad de la luz que pasa a través del capilar en una
pequeña zona en la que se ha eliminado el revestimiento opaco
La detección por fluorescencia resulta más sensible si se emplea una fuente láser muy intensa,
asociada a menudo a un procedimiento de preformación de derivados de los analitos portadores
de un fluoróforo.
Técnicas Electroforéticas
Electroforesis capilar en zona o en disolución libre (CZE)
Es el procedimiento de electroforesis más habitual, en el cual el capilar es recorrido por el
electrolito a través de un medio buffer que puede ser ácido (fosfato o citrato), básico (borato), o
anfótero (carácter ácido y básico). El flujo electroosmótico crece con el pH del medio
electroforético
Electroforesis capilar electrocinética micelar (MEKC)
En esta variante del procedimiento anterior se añade a la fase móvil un compuesto catiónico o
aniónico para formar micelas cargadas. Estas pequeñísimas gotitas inmiscibles con la disolución
retienen a los compuestos neutros de un modo más o menos eficaz, por afinidad hidrófilahidrófoba. Se puede utilizar este tipo de electroforesis para moléculas que tienen tendencia a
migrar sin separación, como es el caso de algunos enantiomeros.
Electroforesis capilar en gel (CGE)
Esta es la transposición de la electroforesis en egel de poliacrilamida o de agarosa. El capilar está
relleno con un electrolito que contiene al gel. Se produce un efecto de filtración que ralentiza a las
grandes moléculas y que minimiza los fenómenos de convección o de difusión. Los
oligonucleótidos, poco frágiles, se pueden separar de este modo.
Isoelectroenfoque capilar (CIEF)
Esta técnica, también conocida como electroforesis en soporte, consiste en crear un gradiente de
pH lineal en un capilar con pared tratada que contiene un anfótero. Cada compuesto migra y se
enfoca al pH que tenga igual valor que su punto isoeléctrico (al pI su carga neta es nula).
Seguidamente, bajo el efecto de una presión hidrostática y manteniendo el campo eléctrico, se
desplazan las especies separadas hacia el detector. Las altas eficiencias obtenidas con este
procedimiento permiten separar péptidos con pI que apenas difieren entre sí 0.02 unidades de pH.
Electrocromatografía Capilar
Este tipo de separación asocia la electromigración de los iones, propio de la electroforesis, y los
efectos de separación entre fases presentes en la cromatografía. La técnica consiste en la utilización
de un capilar relleno con una fase estacionaria, cuyo papel es doble: actúa como material selectivo
que debe, por otro lado, participar en la migración del electrolito.
El factor de separación es muy elevado, pero existen un cierto número de problemas que limitan
su aplicación, como el efecto de los modificadores orgánicos sobre el flujo electroosmótico y la
dificultad de un control preciso del volumen de muestra introducido en el capilar.
Referencia
Castellan, G. (1998) Fisicoquímica, 2 ed. México, Pearson-Adisson Wesley. Págs. 461-462
Rouessac, F. (2003) Análisis Químico: Métodos y Técnicas Instrumentales Modernas.
España, McGraw Hill. Págs. 121-133
Nelson, D. (2001) Lehninger Principios de Bioquímica, 3 ed. España, Omega. Págs. 123-
Publicado por aniux en 21:55
http://javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/electroforesis.html
No hay comentarios:
Publicar un comentario